Чтение генома
Фред Сенгер: «Эта тема [секвенирование] была в центре моих исследований с 1943 года, частично из-за ее увлекательности, частично из-за моей убежденности в том, что знание последовательностей поможет нам гораздо лучше понять живую материю»
К началу 1970-х науке были известны структура ДНК, триплеты, кодирующие белки и множество последовательностей аминокислот, из которых состоят эти клеточные машины. Хэмилтон Смит, Пол Берг и Герберт Бойер уже сделали первые шаги в генетической инженерии, показав, как простые участки ДНК можно переносить из одного организма в другой.
Однако дальнейшему прогрессу в понимании генетики и ее применении в медицине мешал технический барьер. Было очень сложно определить, какие именно части ДНК работают как гены, и прочитать порядок «букв» ДНК, которыми гены записаны.
Первый ген выделил в 1969 году из бактерии американский генетик Джонатан Беквит, а первую последовательность гена, кодирующего оболочку вируса, вычислил бельгийский молекулярный биолог Вальтер Фиерс в 1972 году. Однако эти открытия стали возможны благодаря расшифровке РНК-копий генетического кода, а не самой ДНК. Метод этот был медленный и неэффективный, а поскольку РНК живет очень недолгое время, он подходил только для очень маленьких генов. Стандартного метода считывания последовательности оснований ДНК не существовало, поэтому было мало надежды картировать сложные геномы и тем более определить полные генетические последовательности крупных организмов.
Лучший метод определения последовательности ДНК, то есть секвенирования, разработал в 1975 году Фред Сенгер, британский биохимик, к тому моменту уже получивший одну Нобелевскую премию за определение аминокислотной последовательности инсулина. Его метод изменил биологию и значительно углубил понимание как самих генов, так и того, как ими можно манипулировать, и в конце концов позволил ученым картировать геном человека.
Секвенирование генома
Метод Сенгера заключался в использовании единственной нити ДНК как шаблона в четырех параллельных экспериментах. В каждую из четырех пробирок Сенгер поместил набор из четырех оснований, А, Ц, Г и Т, а также ДНК-полимеразуфермент, использующий основания для синтеза парной нити ДНК. Затем он добавил «волшебный ингредиент» — модифицированную версию одного из оснований, которая, встраиваясь в нить, останавливала реакцию и помечала конец нити радиоактивной меткой.
В ходе реакции образовывались тысячи фрагментов ДНК различной длины, заканчивавшихся на каждом основании исходной нити-шаблона. Затем эти фрагменты пропускали через гель, в котором они распределялись в соответствии со своей длиной, а основание на конце каждого фрагмента считывалось по радиоактивной метке.
Если первые фрагменты, состоящие из одного основания, считываются как тимин, то первая буква — Т. Если фрагменты из двух оснований имеют на конце цитозин, то получаем ТЦ. Трехнуклеотидные фрагменты с гуанином на конце дадут ТЦГ. Таким образом считываются все полученные фрагменты до тех пор, пока каждое место в коде не получит букву.
Такая система, известная как секвенирование обрывом цепи, была значительно быстрее альтернатив. Она была эффективной, надежной и безопасной, тогда как в других методах, разработанных в то же время, использовалось больше ядовитых веществ и более сильное радиоактивное излучение. Метод обрыва цепи быстро стал популярным. Сначала секвенирование делалось вручную. Когда Сенгер использовал метод для считывания генома фага РЫ-Х174 - первого ДНК-организма, у которого был полностью расшифрован геном, - он считывал основания с полосок в куске геля по одному. Этот процесс был дорогим и долгим, но его можно было автоматизировать. В 1986 году Лерой Худ из Калифорнийского технологического института изобрел первый прибор для секвенирования ДНК. Вместо радиоактивных меток Худ использовал для маркировки оснований четыре флуоресцентных красителя, светящихся при сканировании лазером. Компьютер идентифицировал каждый световой сигнал и постепенно восстанавливал всю последовательность. Лаборантам больше не нужно было рассматривать гели. Секвенаторы компании Applied Biosystems («Эпплайд Биосистемс»), начавшей коммерческое производство изобретения Худа, использовались для секвенирования человеческого генома.
Нобелевская премия
Только четыре человека дважды получили Нобелевскую премию, и двое из них были отмечены за вклад в генетику. Фред Сенгер— двукратный нобелевский лауреат в области химии, а Лайнус Полинг получил премию по химии и премию мира. Среди лауреатов по физиологии и медицине также доминируют генетики, особенно после 1950-х годов, когда начался расцвет этой науки. Список лауреатов звучит как «кто есть кто в генетике»: Морган, Мёллер, Бидл, Тейтем, Крик, Уотсон, Уилкинс, Ниренберг, Моно, Смит, Балтимор и Коэн. Половина премий в последние десять лет была вручена за работы, связанные с генетикой.
Охота за генами
Новые методы секвенирования значительно упростили считывание «букв», из которых состоят гены. Однако поиск самих генов оставался непростой задачей. Ученые сначала выделяли из клеток белок - например, адреналин, — затем определяли его аминокислотную последовательность и все возможные комбинации триплетов ДНК, которыми могут быть записаны эти генетические инструкции. Процесс мог занять годы.
Из потенциальных последовательностей ДНК можно было изготовить «ДНК-зонды», которые находили гены в хромосомах, используя свойство двойной спирали, открытое Криком и Уотсоном. Отдельные нити ДНК связываются с другими нитями ДНК, состоящими из парных (или комплементарных) оснований - последовательность АЦГТ свяжется с ТГЦА. ДНК-зонд, несущий часть потенциальной последовательности гена, можно пометить радиоактивной меткой и смешать с генетическим материалом хромосом. Если он к чему-нибудь прилип, то это, скорее всего, нужный ген, который теперь можно выделить, прочитать и картировать его положение на хромосоме.
К концу 1980-х таким способом было обнаружено и секвенировано почти 2000 генов. Одним из них был ген эритропоэтина — белка, стимулирующего образование красных клеток крови, или эритроцитов. Когда компания Amgen («Амген») разработала рекомбинантную версию белка, он стал бестселлером среди лекарств, навсегда изменив лечение анемии. Но, несмотря на огромные инвестиции от фармакологических компаний, надеявшихся на получение новых лекарств, темпы расшифровки оставались медленными.
Темп резко ускорился в начале 1990-х годов благодаря новому методу охоты за генами, разработанному Крейгом Вентером, калифорнийским серфером, занявшимся биологией в уже солидном возрасте после службы санитаром во Вьетнаме. Он понял, что, секвенируя маленькие участки ДНК, копируемые в матричную РНК (сигнальную молекулу, служащую шаблоном для белков), можно создавать «маркерные экспрессируемые последовательности» и с их помощью отлавливать целые гены в ДНК. Вооружившись этим методом, его лаборатория вскоре стала открывать по 60 новых генов в день. Геном начал раскрывать свои секреты.
Первый проект по расшифровке генома человека: митохондриальная ДНК
Человеческий геном состоит из трех миллиардов оснований, и его расшифровка в конце 1970-х годов была за пределами возможностей Сенгера. Однако это не остановило его от участия в меньшем по масштабу проекте по расшифровке человеческого генома. Хотя большая часть ДНК человека хранится в хромосомах в ядре клетки, небольшое количество ДНК содержится в митохондриях, клеточных структурах, производящих энергию. Команда Сенгера взялась за секвенирование этой части нашего генетического кода, и в 1989 году они опубликовали описание 16 569 оснований и 37 генов.
Митохондрии хоть и маленькие, но выполняют важнейшие функции. Дефекты митохондриальных генов могут вызывать тяжелые заболевания. Ученые ищут методы пересадки митохондрий в яйцеклетки, чтобы избежать наследования таких болезней. Поскольку митохондрии передаются по материнской линии практически в неизменном виде, их ДНК также используется для изучения эволюции и нахождения общих предков человека.